Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics by Hubert Rehm, Thomas Letzel

By Hubert Rehm, Thomas Letzel

Die überarbeitete und aktualisierte 7. Auflage dieses Buches gibt einen Überblick über bewährte und neue Methoden der Proteinbiochemie und Proteomics. Es zeigt Auswege aus experimentellen und strategischen Sackgassen. Zudem weckt es ein Gespür für das richtige test zur richtigen Zeit. Behandelt werden klassische Verfahren wie Säulenchromatographie, HPLC, Elektrophoresen, Blots, ELISA, Ligandenbindungstests, die Herstellung von Antikörpern, das Solubilisieren von Membranproteinen, die examine von Glykoproteinen usw. Einen großen Raum nehmen die modernen Verfahren ein: Massenspektrometrie, Proteomics und thermische examine. In die 7. Auflage wurden neue Techniken zur Bestimmung der Wechselwirkung von Proteinen mit Proteinen oder von Proteinen mit kleinen Molekülen aufgenommen: DARTS, DRACALA, SPROX und andere. Des weiteren erfahren Sie, wie guy mit dem Massenspektrometer eine Bindung misst. Auch Methoden zur Herstellung von Bindungsproteinen gegen bestimmte Zielmoleküle werden vorgestellt: Ribosomen demonstrate und DNA- und Peptid-Aptamer-Techniken. Der Fluoreszenznachweis von Proteinen mit Hilfe von Trihalogenverbindungen durfte nicht fehlen und wer die Stabilität und Faltung von Proteinen messen will, kann hier nachlesen, ob er dazu ein CD-Spektrometer benutzen sollte. Auf die Fortschritte in der HPLC und der Massenspektrometrie von Membranproteinen wird ebenso eingegangen wie auf ihre Rekonstitution in Nanoscheibchen (Nanodiscs). Die Mikrodissektion mit UV-Laser, die isoelektrische Fokussierung in Kapillaren und iTRAQ-Tags werden erklärt. Dazu kommt eine Anzahl neuer methods zur Proteinbestimmung, Gelfärbung, Blottechnik, Immunfärbung, Elution aus Gelstückchen etc.

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Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics

Die überarbeitete und aktualisierte 7. Auflage dieses Buches gibt einen Überblick über bewährte und neue Methoden der Proteinbiochemie und Proteomics. Es zeigt Auswege aus experimentellen und strategischen Sackgassen. Zudem weckt es ein Gespür für das richtige test zur richtigen Zeit. Behandelt werden klassische Verfahren wie Säulenchromatographie, HPLC, Elektrophoresen, Blots, ELISA, Ligandenbindungstests, die Herstellung von Antikörpern, das Solubilisieren von Membranproteinen, die examine von Glykoproteinen usw.

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1989) fällen in Lämmli- Gelen das SDS mit 250 mM KCl aus. Dabei werden die Proteine als weiße K-SDS-Komplexe sichtbar. Die Färbung mit KCl sei schonend, schnell und unempfindlich, behaupten die Autoren. Sie mögen recht haben. Der Autor Rehm hält aber die NaAcetat-Färbung für reproduzierbarer als die KClFärbung. Auch lassen sich mit Ersterer die Proteine leichter aus dem Gel eluieren.  B. bei nativen Gelelek- trophoresen, übersteht die Aktivität eines Enzyms die Elektrophorese-Tortur. Sie können dann versuchen, die Enzymbande im Gel selektiv über die Enzymaktivität anzufärben.

Sie erinnern sich: Im Vakuum findet kein Phasenübergang Eis/Wasser statt, sondern das Eis geht direkt in Wasserdampf über (Sublimation). Gefriergetrocknet wird in der Regel bei RT (die Lösung bleibt gefroren, weil ihr dauernd Sublimationswärme entzogen wird). Gefriertrocknen eignet sich für große Volumina von Lösungen, deren Proteine unempfindlich gegen Frieren/Tauen und bei niedrigen Ionenkonzentrationen stabil sind (Pohl 1990). In einer Wanne mit flüssigem N2 wird die Lösung in einem Glasrundkolben unter kreisförmigem Schwenken so eingefroren, dass eine große und gleichmäßig dicke Eisoberfläche entsteht.

Waschen der Taschen mit Wasser nützt wenig, waschen mit Probenpuffer vergrößert das Problem – vermutlich, weil der Probenpuffer die Keratine ins Gel diffundieren lässt. Yokota et al. (2000) beseitigen die Banden, indem sie die Geltaschen mit proteinfreiem Probenpuffer beladen, für 5 min in die falsche Richtung elektrophoretisieren und den Probenpuffer dann entfernen. Die Taschen sind jetzt keratinfrei, und Sie können ihre Probe aufladen. Silberfärbung und Massenspektrometrie Bei der Massenspektrometrie erweist sich die zumindest teilweise irreversible Fixierung der Proteine während der Silberfärbung als Nachteil.

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